Mūmiju audu paraugi ar nosaukumiem "Maria" un "Vavita" tika nosūtīti no Peru uz Krievijas laboratoriju izpētei. Iesniegtie bioloģisko audu paraugi tika pētīti, izmantojot skenējošo elektronu mikroskopiju, Ramana spektrus, ICPE, tika izpētīts diatomīta zemes sastāvs (viela uz mūmiju ādas virsmas). Tika veikts arī nodoto audu DNS pētījums.
Parauga sagatavošana
Audu paraugus, katrs 500 μg, pārnesa plastmasas mēģenēs un izšķīdināja 1 ml buferšķīduma (10 mM Tris-HCl pH = 10,5, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl). Iegūtajām suspensijām Na dodecilsulfātu pievienoja līdz 0,5%, uzsildīja līdz +80 C un pēc 10 minūtēm proteināzi K (līdz 500 μg / ml) 24 stundas ievietoja termostatā (+55 C).
Atdalīšana tika veikta ar fenola metodi: pievienojot suspensijai vienāda tilpuma fenolu, pēc tam fenolu: hloroformu (1: 1), hloroformu; pēc katras pievienošanas leņķa rotoru nepārtraukti maisīja un centrifugēja ar ātrumu 10 tūkstoši apgriezienu minūtē, 10 minūtes.
Super-nogulsnēm, kas iegūtas pēc trešās centrifugēšanas, pievienoja 1/10 daļu 1 M NaCl tilpuma un 2,5 tilpumus divreiz destilēta etilspirta, un atstāja uz nakti -30 ° C koniskajās mēģenēs - "Eppendorf". Centrifugēšana tika veikta ar tilpumu 15 tūkstoši. min. 10 minūšu laikā un saņemtais DNS "izgulsnējas" brūnu nogulsņu veidā. DNS granulu divreiz mazgā ar 70% etilspirtu, žāvē istabas temperatūrā (1 h) un pēc tam izšķīdina TE buferšķīdumā.
PCR tika veikts ar programmējamu termisko ciklistu "My Cycler" ("Bio = Rad"), izmantojot standarta oligoprimetrus, kas sintezēti ar cietās fāzes metodi biedrībā "Beagler" (Sanktpēterburga). Reakcijas maisījums amplifikācijai ar 25 μL tilpumu: 15 nM katra oligoprimera, 67 mM Tris-HCI pH = 8,8 pie +25 C, 16,6 mM (NH4) SO4, 6,7 mM MgCl2, 6,7 μM EDTA, 10 mM 2 merkaptoetanola, 170 μg / ml BSA un četru pamata dNTP maisījums ar koncentrāciju 1,0 mM katrs un termostabils DNS polimerāzes Thermus thermophilis (5 U / μl) (NPO SibEnzim). Pēc denaturācijas (10 minūtes, 94 ° C) katrai testa sistēmai tika veikti 35 amplifikācijas cikli: 94 ° C -1 minūte, 58 ° C - 1 minūte, 72 ° C - 1 min. Lai kontrolētu specifiskumu, reakcijā tika ievadīti DNS paraugi ar zināmiem pētīto loku genotipiem (marķieru sistēmām), kā arī kontroles paraugi.kas satur reaģentu maisījumu bez DNS. Pēc amplifikācijas reakcijas maisījuma alikvotajām daļām (7 μl) tika pievienots krāsošanas buferšķīdums un ar vertikālu elektroforēzi atdalīts 6% poliakrilamīda gēlā (210x150x1 mm), iekrāsots ar etiīdija bromīdu un nofotografēts ultravioletā gaismā. Lai identificētu alēles, tika izmantoti alēļu standarti, kas atbilst šiem lokiem ("trepes").
Reklāmas video:
DNS analīze
Pētījumam mēs izmantojām cilvēka DNS eksomes analīzes metodi, kuras pamatā ir augstas caurlaides spējas sekvencēšana ar bagātināšanu ar hibridizāciju.
Cilvēka DNS eksomes analīzes paņēmiens.
Tika analizēti 2 paraugi … Visi paraugu sagatavošanas posmi pirms PCR tika veikti tīrās telpās. Paraugu sagatavošana, DNS ekstrakcija un atsevišķu DNS fragmentu amplifikācija tika veikta dažādās telpās.
Specifiskos adapterus (KAPA bibliotēku sagatavošanas komplekts un SeqCap adapteru komplekts; Roche) ligēja pie genoma fragmentētās DNS galiem (~ 5 ng), pēc tam, izmantojot AMPureXP lodītes (Beckman Coulter), tika veikta divpakāpju fragmentu atlase 200-350 bp garumā. … Iegūtos fragmentus 28 stundas 47 ° C temperatūrā pastiprināja, izmantojot adapterim specifiskus gruntējumus, un hibridizēja ar biotinilētām specifiskām zondēm (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche). Vienā reakcijā tika apvienoti divi DNS paraugi. Biotinilētie zondes-DNS hibrīdi tika izolēti un attīrīti ar streptovidīna konjugētām magnētiskām daļiņām; tika veikta iegūtā DNS bibliotēkas otrā amplifikācija un kvalitatīvs novērtējums (TapeStation 4200; Agilent Technologies). Lai noņemtu ārpus mērķa esošos amplifikācijas fragmentus un adaptera dimērus, DNS bibliotēka tika atkārtoti attīrīta, izmantojot AMPureXP Beads magnētiskās daļiņas (1. att.). Sagatavotās bibliotēkas galīgā koncentrācija tika novērtēta ar Quantus instrumentu, izmantojot komerciālo QuantiFluor® dsDNA System Kit (Promega). Iegūtā DNS bibliotēka tika imobilizēta uz plūsmas šūnas virsmas. Sekvenēšana tika veikta uz Illumina platformas, izmantojot standarta plūsmas elementu un MiSeq reaģentu komplektu v2 300 (2 x 150 cikli). Iegūtā DNS bibliotēka tika imobilizēta uz plūsmas šūnas virsmas. Sekvenēšana tika veikta uz Illumina platformas, izmantojot standarta plūsmas elementu un MiSeq reaģentu komplektu v2 300 (2 x 150 cikli). Iegūtā DNS bibliotēka tika imobilizēta uz plūsmas šūnas virsmas. Sekvenēšana tika veikta uz Illumina platformas, izmantojot standarta plūsmas elementu un MiSeq reaģenta komplektu v2 300 (2 x 150 cikli).
Attēls: 1
Secināts DNS kvalitātes vispārējs novērtējums
Sākotnējā kvalitātes novērtēšanā tika izmantotas tādas standarta metodes kā FastQC, kā arī Medūzas un KraTER programmas. Kvalitātes novērtējums neuzrādīja kvalitātes problēmas ar secīgiem DNS paraugiem abiem paraugiem. Attēli netiek rādīti, jo tie nav informatīvi.
Pirmajam paraugam (tālāk M, lielajai mūmijai "Maria") tika sekvencēti 113.4M lasījumi, otrajam paraugam (turpmākai W, mazajai mūmijai "WaWita") sekvencēja 22.9M lasījumi.
Nākamais solis bija iztīrīt secētās nolasījumus no dažādām tehniskām sekvencēm, kas traucētu turpmākai analīzei. Tam tika izmantota Cookiecutter programma. Pēc tīrīšanas bija attiecīgi 113,3 M (99%) un 22,8 M (99%) M un W.
Senās DNS daudzuma un tās atdalīšanas no mūsdienu novērtējums
Senās DNS klātbūtnes un daudzuma novērtēšanas standarta metode ir laika gaitā bojāto nukleotīdu daudzuma noteikšana. Tam tika izmantota MapDamage 2.0 programma. MapDamage 2.0, kas uzrādīja senās DNS daudzumu 30,1%, bet, tā kā MapDamage nozīmē, ka mēs izmantojam ciešu atsauci, un mēs precīzi nezinām, cik tuvu abi paraugi ir mūsdienu cilvēku genomam, un mēs izmantojām eksoma bibliotēku, šī metode pati par sevi nebija. pietiekams. Vēl viena laba metode senās DNS novērtēšanai ir īso fragmentu skaits.
Iespējamās senās DNS filtrēšana notika trīs posmos. Pirmajā posmā mēs noņēmām visas pārī nolasītās lappuses, kuras nevar šķērsot, un salieciet vienā pārī lasījumus ar pārklāšanos. Šie lasījumi norādīja, ka oriģinālais fragments, kas tika sakārtots, bija garāks par 300 bp. un, visticamāk, mūsdienu DNS. Tātad pēc šī soļa attiecīgi palika 86,9% un 91,8%. Pēc tam tika atlasīti atsevišķi pārklājošie fragmenti tā, lai to garums būtu mazāks par 150 bp, jo tieši to mēs gaidījām no senās DNS. Pēc šī soļa M un W paraugiem attiecīgi palika 8,6% un 38,5%. Jāatzīmē, ka, neskatoties uz atšķirību procentos, absolūtais nolasījumu skaits starp paraugiem M un W ir ļoti līdzīgs: 9,8M un 8,8M, kas izskaidrojams ar to, ka senās DNS saturs abos paraugos ir līdzīgs.
| Parametrs | M paraugs (Marija) | W paraugs (Wawita) |
| Nolasījumu skaits | 113,3 miljoni | 22,8 miljoni |
| Īso fragmentu procentuālais sastāvs <300 bp | 86,9% | 91,8% |
|
Īso fragmentu procentuālais daudzums <150 bp (skaits) |
8,6% (9,846,035) |
38,5% (8 813 220) |
|
Katra cilvēka genomā izlīdzināto fragmentu procentuālais daudzums (skaits) |
2,03% (2 345 084) |
9,65% (2 264 551) |
| To fragmentu procentuālais sastāvs, kas ir saskaņoti pa cilvēka genomu, no īsiem <150 bāzes punktiem | 23,8% | 25,6% |
DNS iegūšana, kas līdzīga standarta cilvēka genomam
Iegūtā domājamā senā DNS tika kartēta uz atsauces cilvēka genomu, izmantojot standarta genoma variantu meklēšanas cauruļvadu, izmantojot BWA, samtoolus un Wcftools.
Turklāt tikai 23,8% M parauga un 25,6% tika veiksmīgi piesaistīti mūsdienu cilvēku atsauces genomam. Tajā pašā laikā abiem paraugiem 75% secīgo nolasījumu nevarēja attēlot cilvēka genomā. Tas izskaidrojams gan ar piesārņojumu, gan ar to, ka šie paraugi atrodas pietiekami tālu no mūsdienu cilvēku genoma. Tajā pašā laikā ir vērts paturēt prātā, ka mēs esam sakārtojuši eksoma bibliotēku un tādējādi samazinot baktēriju DNS piesārņojumu.
Sākotnējā nevārītu nolasījumu analīze parādīja, ka daži no tiem pieder pie atkārtotiem DNS, kas raksturīgi nagaiņiem, to var izskaidrot ar faktu, ka mumifikācijā tika izmantoti lamu tauki.
Sīkāka analīze prasa apmēram trīs nedēļu aprēķinus, jo esošie risinājumi tika veikti tikai vīrusu un baktēriju genomiem, un mums ir jāsalīdzina ar visiem esošajiem genomiem, ieskaitot augu genomus, lai saprastu, kuras sugas tika sakārtotas.
Atrasto iespēju raksturojums
Kartētie lasījumi tika izmantoti, lai meklētu variantus, kas atšķir M un W paraugus no mūsdienu cilvēka genoma, kā arī lai novērtētu lasījumu piesārņojumu no cilvēka Y hromosomas.
Pirmais jautājums, uz kuru vajadzēja atbildēt, bija tas, pie kurām hromosomām tika sakārtotas secības.
Tā kā mēs zinām, ka Marijas paraugi tika izolēti no kauliem un muskuļiem, bet Vavita - tikai no kauliem, mēs gaidījām mtDNS daudzuma atšķirības. Bet nebija daudz atšķirību.
Kartēto lasījumu skaits Y ir vēl viens mūsdienu cilvēku veiktais piesārņojuma tests. Interesanti, ka abos paraugos tas izrādījās vienāds.
Statistika par atrastajiem variantiem ir parādīta zemāk:
| Parametri | M paraugs (Marija) | W paraugs (Wawita) |
| Atrasto iespēju skaits | 79957 | 48941 |
| Opciju skaits Y | 534 | 541 |
| Uzticamu iespēju skaits (vairāk nekā 20 lasījumu un vairāk nekā 30 kvalitātes) | 16969. gads | 6181 |
| Varianti ar zināmu rsid (pieejami snip datu bāzē) | 5701. lpp | 3089. gads |
| Vispārīgas derīgas iespējas | 92 | |
| kopīgas iespējas ar rsid | 49 |
Pēc tam kļuva iespējams atbildēt uz jautājumu: vai M un W radinieki? Atbilde ir nē.
Tika atrasti tikai 49 atbilstošie varianti no M līdz W un 3040, kas atšķiras variantiem ar zināmu rsid. Turklāt, iespējams, tie ir dažādi cilvēka vai nezināmas radības veidi vai pasugas.
Interesanti, ka varianti ar Y hromosomu ir identiski abiem paraugiem, kas norāda uz vienas personas inficēšanos, un ka Y hromosomas senajā DNS, iespējams, joprojām nav hromosomas.
Novērtējums par līdzību ar esošajiem sekvencētajiem cilvēku genomiem no projekta “1000 cilvēka genoma”
Ņemiet vērā, ka šī ir tikai aptuvena analīze, jo precīzākas analīzes veikšanai ir nepieciešami varianti no genoma reģioniem neitrālā atlasē, un mums ir exome dati.
Tomēr, izmantojot 5708 variantus M vai 3096 S, bija iespējams veikt analīzes variantu, salīdzinot ar datiem no 1000 cilvēka genomiem.
PCA analīzes rezultāts zemāk redzamajā attēlā ir divu M un W attēlu pārklājums, kas aprēķināts atsevišķi, jo starp M un W ir pārāk maz izplatītu iespēju, lai novērtētu attālumus starp M un W.
Līdzības rādītājs.
Kā redzat, nav nejaušības ar kādu no gēnu grupām, tie arī atšķiras viens no otra. Bet jāpatur prātā, ka mēs izvēlējāmies kodēšanas secības, un neitrālā atlasē ieteicams izmantot variantus.
Neskatoties uz to, PCA rezultāts ir labi savienojams ar manuālu variantu pārbaudi, kas parādīja, ka dati atrodas nenorādītā homozigotā, kas atkal norāda, ka attēli ir tālu no mūsdienu cilvēka genoma.
Secinājums
Diemžēl mēs aprobežojāmies tikai ar diviem paraugiem, parasti šāda veida analīzēs izmanto vairāk, vismaz 3–10 vismaz kaut kādā veidā saistītus. Tāpēc ir jāturpina pētījumi ar lielu skaitu paraugu.
Tajā pašā laikā mēs, visticamāk, varam secināt, ka Marijas un Vavitas DNS paraugi atbilst cilvēka DNS, bet nesakrīt ar DNS, kas mums pieejama no 1000 cilvēku datu bāzes.
Ziņojuma autori: Baranov V. S. un Aseev M. V. (Dzemdību un ginekoloģijas zinātniski pētnieciskais institūts, pirmsdzemdību diagnostika), Glotov A. S. un Glotovs O. S. (Sanktpēterburgas Valsts universitāte), A. Komissarovs (Krievijas Zinātņu akadēmijas Citoloģijas institūts, Ģenētiskās bioinformātikas centrs).
Materiāli, ko sniedza Konstantīns Georgijevičs Korotkovs (tehnisko zinātņu doktors, Informācijas tehnoloģiju, mehānikas un optikas universitātes profesors) un Dmitrijs Vladislavovičs Galetskis (medicīnas zinātņu kandidāts, I. P. Pavlova pirmā Sanktpēterburgas Valsts medicīnas universitāte).
Lai uzzinātu vairāk par Nazca mūmijām, skatiet tagu: Nazca mūmijas.
