CRISPR-Cas gēna redaktora izgudrojums tiek saukts par revolūciju bioloģijā. Zinātnieki sola to izmantot, lai uzlabotu augu šķirnes un dzīvnieku šķirnes lauksaimniecībai, lai ārstētu iedzimtas ģenētiskas slimības cilvēkiem. RIA Novosti korespondents devās apskatīt, kurš un kā tiek rediģēts genoms.
Maskavas Valsts universitātes Genoma rediģēšanas centrs tika atvērts nedaudz vairāk nekā pirms gada - universitātes pilsētiņā. Mani sagaida tās direktors, ķīmijas doktors Pēteris Sergijevs, un, kamēr mēs braucam ar liftu, viņš nedaudz veltī gēnu inženierijas vēsturei.
“Genoms ir rediģēts jau iepriekš. Bet tam bija grūti radīt instrumentus, tas prasīja daudz laika, un rezultāts bieži nebija tāds, kādu mēs gribējām,”viņš saka.
Vivārijā Pjotrs Vladimirovičs mainās uz zilām laboratorijas drēbēm, viņi man iedod vienreiz lietojamu baltu kombinezonu un lūdz noslaucīt kameru ar spirtu. Tagad Petrs Vladimirovičs izskatās kā ķirurgs, un es - kā laboratorijas asistents no sērijas “CSI - nozieguma aina”.
Sterilā laboratorijā mums ir sagatavots trauks ar apaugļotām peļu olām un mēģene ar RNS šķīdumu. Tas ir viss, kas jums nepieciešams CRISPR-Cas genoma rediģēšanai.
CRISPR ir angļu valodas akronīms frāzei, kas burtiski nozīmē "regulāri sagrupēti īsi palindromiski atkārtojumi". Faktiski šīs ir tikai nelielas bakteriofāgu vīrusu DNS sadaļas, kas iestrādātas baktēriju genomā. Šīs sekvences ir vajadzīgas, lai baktēriju imūnsistēma darbotos un kalpotu kā sava veida paziņojums par "policijas vēlmi". Ja baktērija izdzīvo pēc inficēšanās ar bakteriofāgu, tā izmanto Cas olbaltumvielu fermentus, lai izgrieztu tās DNS gabalu un ievietotu to genomā, lai vēlāk tos atpazītu. Baktēriju genoms manto šo "ienaidnieku" bibliotēku, kuru rūpīgi savāc iepriekšējās paaudzes.
2013. gadā zinātnieki uzzināja, ka Cas olbaltumvielas darbojas jebkurā organismā, ieskaitot zīdītājus. Viņš spēj veikt virziena pārtraukumus abās DNS molekulas daļās un tādējādi mainīt genomu.
Reklāmas video:
Manipulācijas ar olu
Petrs Sergijevs pie mikrotēkla izveido stikla kapilāru ar simt mikronu diametru, ievelk tajā olu un ar barības vielu pārnes zem stikla. Gatavo paraugu nosūta uz optiskā mikroskopa stadiju. Monitorā tiek parādīts palielināts olšūnas attēls, kas kapilāra galā šķirstās. Izceļas divi noapaļoti plankumi - tie ir kodoli ar mātes un tēva DNS.
Zinātnieks sagatavo vēl vienu kapilāru, kura diametrs ir mazāks par lielumu. Šī ir injekcijas šļirce. Tajā tiek savākts šķīdums ar divu veidu RNS un ar manipulatoru palīdzību viegli caurdurta olšūna. Tas ir tas, injekcija tiek veikta.
RNS, kas ievadīta olšūnā, ir nepieciešama, lai noteiktā vietā sagrieztu genomu. Viena veida RNS satur stingri noteiktu nukleotīdu secību, līdzīgu tai, kuru mēs domājām mainīt. Šīs RNS uzdevums ir atrast atbilstošo reģionu DNS, tāpēc to sauc par “ceļvedi”. Otra veida RNS, matrica, ir sava veida instrukcija Cas9 nukleāzes olbaltumvielu sintēzei. Šis proteīns darbojas kā katalizators ķīmiskai reakcijai, kas sarauj fosfodiestera saites starp precīzi definētām DNS bāzēm. Tā kā olbaltumvielu molekulā ir divi nukleāzes centri, tiek atvērti abi DNS virzieni, turklāt vietā, kuras Cas9 koordinātas "saskaitītas" ar virzošo RNS.
DNS molekula uztver abu virzienu pārrāvumu kā nopietnu sadalījumu un mēģina to labot. Šūnā peldošie eksonukleāzes fermenti nekavējoties noņem vairākus nukleotīdus no abiem pārtraukuma galiem. Tas ir pietiekami, lai sašķeltu vai, kā saka ģenētiķi, “izslēgtu” gēnu.
Kā darbojas CRISPR-Cas9 genomikas redaktors / RIA Novosti ilustrācija. Alīna Poļjaņina.
Ja, piemēram, ir nepieciešama virzīta mutācija, ir nepieciešams iezīmēt olbaltumvielu, lai to izsekotu ķermenī, tad divām šūnām RNS tiek pievienots vēl viens šablons speciāli izveidotas DNS formā. Tas sastāv no sekvencēm, kas ir identiskas nākotnes pārtraukuma malām, un tajā ir arī ievietojamā sadaļa. Pēc tam, kad Cas9 ir sagriezis DNS molekulu, tā gali tiek savienoti, izmantojot šo papildu veidni, tāpēc pārtraukumā tiek ievietots mums nepieciešamais nukleotīdu komplekts.
“Vāverei varam piestiprināt nelielu asti, pa kuru ir ērti to izvilkt un redzēt, ar ko tā mijiedarbojas. Mēs varam ievietot gēnu, taču tas nav tik efektīvs kā tā izslēgšana,”turpina skaidrot zinātnieks.
ĢMO un himeras
Rediģētā olšūna tiks pārstādīta surogātmātes dzemdes caurulē. Kādu laiku viņa dzīvoja kopā ar tēviņu, kura olšūnas bija saistītas. Pārim bija normāla seksuālā dzīve, bet viņš nevarēja iedomāties. Neskatoties uz to, peles ķermenis uzskatīja, ka viņa ir stāvoklī, un veidoja viņai piemērotu hormonālo fonu. Tagad šī mātīte nes kāda cita augli.
Trīs nedēļu laikā viņa dzemdēs parastākās peles. Zinātnieki gaidīs, kamēr grauzēji izauga, paņem no tiem nelielu astes gabalu un izmanto PCR, lai analizētu rediģēto DNS gabalu. Vairāk nekā pusē gadījumu tiek konstatēta mutācija vai gēns ar invaliditāti. Apgrieztā procedūra - sekvences ievietošana genomā - izdodas ne vairāk kā 10% eksperimentu.
Rediģējot, parādās dažādi interesanti efekti. Piemēram, piedzimst peļu mozaīkas jeb himeras, kurām ir šūnas ar dažādām mātes un tēva genomu variācijām. Cas9 var sagriezt DNS daudzas reizes, bet Messenger RNS, kas to kodē, nav mūžīgs, un ievadītais šķīdums vienkārši pazūd virknē šūnu dalīšanas. Dažreiz redaktors joprojām tiek atlaists no jauna pēc tam, kad ir saplūduši kodoli un dalīta olšūna. Un tā kā DNS labošana pēc pārrāvuma vienmēr ir nejaušs process un dziedināšana nekad nenotiek vienādi, tad dažās viena organisma šūnās būs cita mutācija.
Zinātnei un medicīnai
Mēs pārvācamies uz blakus esošo istabu, lai skatītos genoma rediģēšanas eksperimentu tiešos rezultātus. Plauktos kreisajā pusē - konteineri ar ģenētiski modificētām pelēm, labajā pusē - ar parastajiem grauzējiem kontrolei. Viņi tika audzēti, tāpat kā kreisajā pusē, bet ar genomu netika veiktas manipulācijas. Kontroles peles ir vajadzīgas, lai mūsu acu priekšā būtu norma un salīdzinātu eksperimentā iegūtās radības ar to.
Pjotrs Sergijevs paņem vienu no konteineriem ar pelēko peļu pāri. Ārēji viņi ir pilnīgi parasti, bet viņiem nav pēcnācēju. Fakts ir tāds, ka vīriešiem tiek izslēgts vienas RNS metiltransferāzes gēns - enzīms, kas ražots tikai spermā. Tēviņi ar neaktīvu gēnu piedzimst sterili. Precīzs gēna un fermenta mērķis joprojām nav zināms. Lai to uzzinātu, laboratorijā tika audzēti divi peļu celmi: vienam bija izslēgts gēns, otram bija proteīns, kas apzīmēts ar genoma redaktoru.
“Šī gēna mutācija ir sastopama arī cilvēkiem - tad cilvēks cieš no neauglības. Bet, kamēr mēs uzzināsim, kāpēc tas ir vajadzīgs, kāpēc tas modificē RNS, mēs nevarēsim palīdzēt šādiem pacientiem,”iemeslus skaidro zinātnieks.
Patiesībā mēs joprojām nezinām vairuma cilvēku gēnu funkcijas. Uzzināt to ir būtisks uzdevums, kuru ir atrisinājušas daudzas pētniecības grupas visā pasaulē, arī Krievijā. Peles genoms ir ļoti līdzīgs cilvēkiem. Jācer, ka, izmantojot CRISPR-Cas, jebkuras radības genoma izpēte notiks ātrāk.
Sergijeva grupa kopā ar N. N. NN Petrova sāka meklēt mutācijas, kas izraisa dažus vēža veidus. Tuvākajos plānos ietilpst ģenētiski modificētu lauksaimniecības dzīvnieku izveides projekts sadarbībā ar Viskrievijas Dzīvnieku audzēšanas pētījumu institūtu un Krievijas Zinātņu akadēmijas Gēnu bioloģijas institūtu.
“CRISPR-Cas ir fantastisks rīks, kas ļauj mainīt genomu pēc saviem ieskatiem, būt mazliet Dieva. Galu galā zinātnes uzdevums ir saprast, kā darbojas tik sarežģīts radījums kā zīdītājs,”saka zinātnieks.
Zinātnes pamatproblēmu atrisināšana ir lieliska, bet ko šī tehnoloģija dos medicīnai? Paredzamā nākotnē diemžēl ne maz. Ir viegli rediģēt olu un audzēt ģenētiski modificētu peli, taču nav iespējams labot pieauguša dzīvnieka gēnus, nemaz nerunājot par cilvēku.
DNS rediģēšanas metodes somatiskajās (tas ir, jau izveidotās šūnās) joprojām ir ļoti neefektīvas. Lai šūnā ievestu kādu gēnu, kas izslēgts ar mutāciju, un piespiestu to ražot noteiktu olbaltumvielu, jums jānoņem dažas šūnas no ķermeņa, jārediģē tajās esošā DNS un jāievieto atpakaļ ķermenī. Principā ir cerība, ka šādā veidā būs iespējams cīnīties ar tādām slimībām kā Duchenne muskuļu distrofija vai cistiskā fibroze, kad ir nepieciešams atjaunot kādas šūnu daļas darbspējas. Kas attiecas uz noslieci uz vēzi, tad līdz šim genoma redaktors ir bezspēcīgs. Ja cilvēkā tiek atrasts mutants gēns, tad tas ir atrodams visās ķermeņa šūnās. Nav reāli mainīt tos visus. Un katra šūna ar mutāciju ir bīstamības avots.
Bet pat ja CRISPR / Cas palīdzēs atbildēt tikai uz dažiem pamatjautājumiem un ļaus ārstēt retas ģenētiskas slimības, tas cilvēcei joprojām būs liels solis uz priekšu.
Tatjana Pičugina