Zinātnieki ļoti cer uz tehnoloģiju CRISPR / Cas9, kas ļauj ļoti precīzi mainīt dzīvo organismu, tostarp cilvēku, genomus. Tiek publicēti visi jaunie zinātniskie raksti, aprakstot dažāda veida CRISPR sistēmas, kā arī to modifikācijas. "Lenta.ru" stāsta par atklājumiem šajā jomā, kas veikti 2016. gadā.
Tūkstošiem no tiem
CRISPR / Cas9 ir baktēriju adaptīva imunitātes sistēma, kas ļauj mikroorganismiem cīnīties ar vīrusiem. Tas sastāv no starplikām - DNS sekcijām, kas atbilst noteiktiem infekcijas izraisītāja DNS fragmentiem (protospacers). Spacers kodē specifiskas crRNS molekulas, kas saistās ar Cas9 fermentu. Iegūtais komplekss piestiprinās vīrusa DNS ķēdei, un Cas9 darbojas kā šķēres, to sagriežot.
Patiesībā CRISPR / Cas9 ir tikai viena no daudzām līdzīgām sistēmām, kādas ir baktērijām un arhejām. Zinātnieki tos iedala divās klasēs. Pirmajā klasē ietilpst I, III un IV tipa CRISPR sistēmas, bet otrajā - II un V. II tips satur Cas9 proteīnu, kas iesaistīts jaunu starpliku iegūšanā, crRNS uzkrāšanā šūnā un DNS šķelšanā. Citās sistēmās šiem mērķiem tiek izmantoti daudzproteīnu kompleksi. Tas padara II tipu par vienkāršāko CRISPR sistēmas veidu, kas piemērots gēnu inženierijas vajadzībām.
Savukārt tipus var iedalīt apakštipos atkarībā no tā, kuri papildu gēni ir saistīti ar CRISPR. Piemēram, IIA sistēmas satur csn2 gēnu, kas kodē olbaltumvielu, kas saistās ar DNS un ir iesaistīta starpliku iegūšanā. IIB sistēmās csn2 nav, bet ir cas4 gēns, kura funkcija joprojām nav zināma, un IIC sistēmās nav ne csn2, ne cas4.
Bagātības baktēriju iekšienē
Reklāmas video:
Visas zināmās CRISPR sistēmas zinātnieki ir atklājuši baktērijās, kas audzētas laboratorijas apstākļos. Tomēr ir milzīgs skaits neapstrādātu mikroorganismu, kas ietver gan arhejas, gan baktērijas. Viņi parasti dzīvo ekstremālos apstākļos - minerālu avotos vai toksiskās ūdenstilpnēs pamestās raktuvēs. Tomēr pētnieki var izolēt no tiem DNS un noteikt tajā konkrētus reģionus. Jaunā rakstā, kas 22. decembrī publicēts rakstā Nature, Kalifornijas Universitātes Bērklija ģenētiķi ir dekodējuši dabisko mikrobu kopienu genomus, atklājot citas CRISPR sistēmas variācijas.
Bakteriofāgs - vīruss, kas inficē baktērijas
Attēls: Giovanni Cancemi / Depositphotos
Zinātniekiem izdevās noskaidrot, ka dažiem maz pētītiem arkas veida nanoorganismiem ARMAN ir arī CRISPR / Cas9, lai gan iepriekš tika uzskatīts, ka tikai baktērijām tie ir. Tiek atzīmēts, ka šī sistēma ieņem starpvietu starp IIC un IIB apakštipiem un var kalpot kā aizsardzība pret parazitāriem "lecošiem" gēniem (transpozoniem), kas mikroorganismā nonāk no citām arhejām. Mēģinājums reproducēt arheāla CRISPR / Cas9 aktivitāti E. coli (Escherichia coli) neko nedeva, kas norāda uz dažu papildu īpašu mehānismu esamību, kas regulē sistēmu.
Jauni otrās klases sistēmu veidi - CRISPR / CasX un CRISPR / CasY - tika izolēti arī no baktērijām, kas dzīvo gruntsūdeņos un nogulsnēs. CRISPR / CasX sistēmā ietilpst olbaltumvielas Cas1, Cas2, Cas4 un CasX. Pēdējais, kā parādīts eksperimentos ar E. coli, atšķiras ar nukleāzes aktivitāti, tas ir, tas spēj sašķelt svešu DNS, piemēram, Cas9. Tomēr tas notiek tikai tad, ja TTCN secība atrodas prototipu priekšā, kur N ir kāds no četriem nukleotīdiem. Šādas sekvences sauc par PAM (protospacer blakus motīvs - motīvs blakus protospacer). CRISPR / Cas9 sistēmai ir arī savs PAM - NGG, kam jāatrodas aiz prototipa. Turklāt CRISPR / CasY spēj sagriezt DNS, ja mērķa vietas tuvumā ir TA PAM sekvence.
Kāds ir šī atklājuma solījums? Fakts ir tāds, ka atklātās sistēmas ir viskompaktākās, kas šobrīd zināmas. Pēc zinātnieku domām, nelielais olbaltumvielu daudzums, kas nepieciešams viņu darbam, padara CRISPR / CasX un CRISPR / CasY ērtus rīkus DNS rediģēšanai. Turklāt metagenomiskie pētījumi, kuros tiek pētīta no vides iegūtā DNS, atklās cita veida CRISPR sistēmas, kas ir noderīgas gēnu inženierijai.
Ceļš uz izcilību
Protams, CRISPR sistēmu meklēšanai dabā ir alternatīva - jau esošās CRISPR / Cas9 tehnoloģijas uzlabošana. Neskatoties uz augsto precizitāti, viņa pieļauj kļūdas, sagriežot DNS nepareizajā vietā. Tas apgrūtina pareizu izmaiņu veikšanu gēnos un tādējādi efektīvi ārstē iedzimtas slimības. Tāpēc zinātnieki meklē veidus, kā uzlabot sistēmas darbību. 2016. gadā ir bijuši daudzi zinātniski darbi, kas veltīti CRISPR modificēšanai un pārveidošanai par dažādiem gēnu rīkiem.
Olbaltumvielas Cas9 un crRNS - galvenās CRISPR sistēmas sastāvdaļas
Attēls: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
Tātad 8. decembrī žurnāls Cell publicēja Toronto universitātes zinātnieku rakstu, kas izveidoja "anti-CRISPR" - sistēmu, kas noteiktos apstākļos izslēdz mehānismu. Tas ļauj nomākt Cas9 aktivitāti, ja vadošā RNS saistās ar nepareizo fragmentu un novērš kļūdas. Anti-CRISPR sastāv no trim nukleāzi inhibējošiem proteīniem. Protams, sākotnēji to nav izgudrojuši zinātnieki, bet gan vīrusi, kas tādējādi neitralizēja baktēriju imunitāti.
Jūnijā amerikāņu pētnieki kopā ar kolēģiem no Krievijas apstiprināja, ka CRISPR / C2c2 sistēma, kas iegūta no fusobacterium Leptotrichia shahii, spēj sagriezt vienpavediena RNS. Tā rezultātā CRISPR sistēmu var izmantot, lai izspiestu - nomāktu funkcijas - kurjera RNS, kas informāciju pārnes no gēniem uz ribosomām, kur uz tās pamata tiek sintezēti proteīni.
Maijā Kalifornijas universitātes pētnieki izveidoja tehnoloģiju CRISPR-EZ, kas ļauj ar gandrīz simtprocentīgiem panākumiem peles embriju genomos ievietot jaunas DNS molekulas. CRISPR / Cas9 sistēmu injicē apaugļotās dzīvnieku olās, izmantojot mikroskopisku adatu un niecīgu elektrisko izlādi. Eksperimentā zinātniekiem 88 procentos peles izdevās ieviest gēna mutāciju. Tas pārsniedz to ģenētiski modificēto pelu skaitu, kuras ražo, rediģējot CRISPR, kurā tiek izmantotas parastās injekcijas.
Aprīlī, izmantojot Cas9 mutantu variantu, kuram nav nukleāzes aktivitātes, Masačūsetsas Universitātes Medicīnas skolas molekulārie biologi izstrādāja CRISPRainbow tehnoloģiju. Virzošā RNS, kas norāda, kur fermenti saistās, saturēja fluorescējošas etiķetes, kas ļauj, piemēram, izsekot mobilo ģenētisko elementu kustībai.
Anopheles moskīts var būt pirmais CRISPR sistēmu upuris
Foto: Jim Gathany / Wikipedia
Drosmīgā jaunā pasaule
Zinātnieki jau izmanto CRISPR sistēmas, lai radītu ģenētiski modificētus organismus, piemēram, malārijas odus, kas izplatīja kaitīgos gēnus savvaļas radinieku vidū. Šo metodi sauc par gēnu piedziņu. Ja kāds no indivīda vecākiem bija mutanta gēna nesējs, tad viņš ar 50 procentu varbūtību nodos to savām atvasēm. Tas ir tāpēc, ka vecākiem ir divas gēna kopijas, un tikai viena no tām ir bojāta. CRISPR spēj nokopēt mutanta fragmentu un ievietot to veselīgā gēnā. Tā rezultātā pēcnācēji iegūst mutāciju ar 100% varbūtību.
Rekombinantās DNS konsultatīvās komitejas (RAC) eksperti 2016. gadā apstiprināja Pensilvānijas universitātes pieteikumu veikt cilvēka ģenētiskās modifikācijas testus, izmantojot CRISPR / Cas9 tehnoloģiju.
Tomēr ķīnieši viņus apsteidza. Novembrī žurnāls Nature ziņoja, ka ķīniešu zinātnieki pirmo reizi ieveda cilvēkos šūnas ar CRISPR / Cas9 sistēmas modificētiem gēniem. Pētnieki no metastātiska plaušu vēža pacienta asinīm ieguva imūnās šūnas (T limfocītus) un pēc tam ar CRISPR tehnoloģiju izslēdza gēnu, kas kodē PD-1 olbaltumvielu. Ir pierādīts, ka pēdējais nomāc imunitāti, veicinot audzēja augšanu. Zinātnieki kultivēja rediģētās šūnas, palielinot to skaitu un pēc tam injicējot tās atpakaļ cilvēka ķermenī. Vai gēnu terapija tiks galā ar šo slimību, vēl jānoskaidro.
CRISPR sistēmas var izmantot arī HIV un cilvēku iedzimtu slimību apkarošanai. Tomēr, lai izstrādātu efektīvu ārstēšanu, ir nepieciešami turpmāki pētījumi. Protams, mēs nerunājam par mutantiem, kā tas ir zinātniskās fantastikas filmās, taču zinātnieki varēs ātri izveidot ģenētiski modificētus organismus, piemēram, lauksaimniecības augus ar izturību pret parazītiem. Jāskatās, kāpēc zinātnieki, kuri atklāja CRISPR un izdomāja, kā to varētu izmantot, vēl nav saņēmuši Nobela prēmiju.
Aleksandrs Enikejevs